Identification of novel 2-(1H-Indol-1-yl)benzohydrazides CXCR4 ligands impairing breast cancer growth and motility

Stromal-derived-factor-1 (SDF-1) and the G-protein-coupled receptor CXCR4 are involved in several physiological and pathological processes including breast cancer spread and progression. Several CXCR4 antagonists have currently reached advanced development stages as potential therapeutic agents for different diseases. Results: A small series of novel CXCR4 ligands, based on a 2-(1H-indol-1-yl)-benzohydrazide scaffold, has been designed and synthesized. The interaction with CXCR4-active site was predicted by molecular docking and confirmed by whole cell-based [125I]-SDF-1 ligand competition binding assays. One of the synthesized compounds was particularly active in blocking SDF-1-induced breast cancer cell motility, proliferation and downstream signaling activation in different breast cancer cell models and coculture systems. Conclusion: The newly synthesized compounds represent suitable leads for the development of innovative therapeutic agents targeting CXCR

Pulmonary venous circulating tumor cell dissemination before tumor resection and disease relapse

Approximately 50% of patients with early-stage non-small-cell lung cancer (NSCLC) who undergo surgery with curative intent will relapse within 5 years1,2. Detection of circulating tumor cells (CTCs) at the time of surgery may represent a tool to identify patients at higher risk of recurrence for whom more frequent monitoring is advised. Here we asked whether CellSearch-detected pulmonary venous CTCs (PV-CTCs) at surgical resection of early-stage NSCLC represent subclones responsible for subsequent disease relapse. PV-CTCs were detected in 48% of 100 patients enrolled into the TRACERx study3, were associated with lung-cancer-specific relapse and remained an independent predictor of relapse in multivariate analysis adjusted for tumor stage. In a case study, genomic profiling of single PV-CTCs collected at surgery revealed higher mutation overlap with metastasis detected 10 months later (91%) than with the primary tumor (79%), suggesting that early-disseminating PV-CTCs were responsible for disease relapse. Together, PV-CTC enumeration and genomic profiling highlight the potential of PV-CTCs as early predictors of NSCLC recurrence after surgery. However, the limited sensitivity of PV-CTCs in predicting relapse suggests that further studies using a larger, independent cohort are warranted to confirm and better define the potential clinical utility of PV-CTCs in early-stage NSCLC

Anti-estrogen Resistance in Human Breast Tumors Is Driven by JAG1-NOTCH4-Dependent Cancer Stem Cell Activity

Breast cancers (BCs) typically express estrogen receptors (ERs) but frequently exhibit de novo or acquired resistance to hormonal therapies. Here, we show that short-term treatment with the anti-estrogens tamoxifen or fulvestrant decrease cell proliferation but increase BC stem cell (BCSC) activity through JAG1-NOTCH4 receptor activation both in patient-derived samples and xenograft (PDX) tumors. In support of this mechanism, we demonstrate that high ALDH1 predicts resistance in women treated with tamoxifen and that a NOTCH4/HES/HEY gene signature predicts for a poor response/prognosis in 2 ER+ patient cohorts. Targeting of NOTCH4 reverses the increase in Notch and BCSC activity induced by anti-estrogens. Importantly, in PDX tumors with acquired tamoxifen resistance, NOTCH4 inhibition reduced BCSC activity. Thus, we establish that BCSC and NOTCH4 activities predict both de novo and acquired tamoxifen resistance and that combining endocrine therapy with targeting JAG1-NOTCH4 overcomes resistance in human breast cancers

Allele-Specific HLA Loss and Immune Escape in Lung Cancer Evolution

Immune evasion is a hallmark of cancer. Losing the ability to present neoantigens through human leukocyte antigen (HLA) loss may facilitate immune evasion. However, the polymorphic nature of the locus has precluded accurate HLA copy-number analysis. Here, we present loss of heterozygosity in human leukocyte antigen (LOHHLA), a computational tool to determine HLA allele-specific copy number from sequencing data. Using LOHHLA, we find that HLA LOH occurs in 40% of non-small-cell lung cancers (NSCLCs) and is associated with a high subclonal neoantigen burden, APOBEC-mediated mutagenesis, upregulation of cytolytic activity, and PD-L1 positivity. The focal nature of HLA LOH alterations, their subclonal frequencies, enrichment in metastatic sites, and occurrence as parallel events suggests that HLA LOH is an immune escape mechanism that is subject to strong microenvironmental selection pressures later in tumor evolution. Characterizing HLA LOH with LOHHLA refines neoantigen prediction and may have implications for our understanding of resistance mechanisms and immunotherapeutic approaches targeting neoantigens. Video Abstract [Figure presented] Development of the bioinformatics tool LOHHLA allows precise measurement of allele-specific HLA copy number, improves the accuracy in neoantigen prediction, and uncovers insights into how immune escape contributes to tumor evolution in non-small-cell lung cancer

Fc-Optimized Anti-CD25 Depletes Tumor-Infiltrating Regulatory T Cells and Synergizes with PD-1 Blockade to Eradicate Established Tumors

CD25 is expressed at high levels on regulatory T (Treg) cells and was initially proposed as a target for cancer immunotherapy. However, anti-CD25 antibodies have displayed limited activity against established tumors. We demonstrated that CD25 expression is largely restricted to tumor-infiltrating Treg cells in mice and humans. While existing anti-CD25 antibodies were observed to deplete Treg cells in the periphery, upregulation of the inhibitory Fc gamma receptor (FcγR) IIb at the tumor site prevented intra-tumoral Treg cell depletion, which may underlie the lack of anti-tumor activity previously observed in pre-clinical models. Use of an anti-CD25 antibody with enhanced binding to activating FcγRs led to effective depletion of tumor-infiltrating Treg cells, increased effector to Treg cell ratios, and improved control of established tumors. Combination with anti-programmed cell death protein-1 antibodies promoted complete tumor rejection, demonstrating the relevance of CD25 as a therapeutic target and promising substrate for future combination approaches in immune-oncology

Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.

The early detection of relapse following primary surgery for non-small-cell lung cancer and the characterization of emerging subclones, which seed metastatic sites, might offer new therapeutic approaches for limiting tumour recurrence. The ability to track the evolutionary dynamics of early-stage lung cancer non-invasively in circulating tumour DNA (ctDNA) has not yet been demonstrated. Here we use a tumour-specific phylogenetic approach to profile the ctDNA of the first 100 TRACERx (Tracking Non-Small-Cell Lung Cancer Evolution Through Therapy (Rx)) study participants, including one patient who was also recruited to the PEACE (Posthumous Evaluation of Advanced Cancer Environment) post-mortem study. We identify independent predictors of ctDNA release and analyse the tumour-volume detection limit. Through blinded profiling of postoperative plasma, we observe evidence of adjuvant chemotherapy resistance and identify patients who are very likely to experience recurrence of their lung cancer. Finally, we show that phylogenetic ctDNA profiling tracks the subclonal nature of lung cancer relapse and metastasis, providing a new approach for ctDNA-driven therapeutic studies

<<The>> role of intrinsic and extrinsic signals in the regulation of brest cancer stem cell activity

Dottorato di Ricerca in Biochimica Cellulare ed Attività dei Farmaci in Oncologia, Ciclo XXVIII, a.a. 2015--2016Il carcinoma mammario rappresenta la neoplasia a maggiore incidenza nel sesso femminile. Nonostante i numerosi progressi da un punto di vista diagnostico e terapeutico, metastasi e recidiva tumorale rappresentano ancora le principali cause di morte nelle pazienti affette da carcinoma mammario. Recentemente, numerosi studi hanno suggerito la presenza di una sottopopolazione di cellule con caratteristiche di staminalità chiamate cellule staminali tumorali (CSCs), che svolgono un ruolo importante nel sostegno della crescita e della progressione tumorale. Le CSCs, così come le cellule staminali normali, sono caratterizzate dalla capacità di auto-rinnovamento (self-renewal) e di differenziazione. Da un punto di vista clinico, il principale problema inerente le cellule staminali tumorali, riguarda la loro resistenza ai trattamenti convenzionali (terapia endocrina, chemio- e radioterapia), caratteristica che potenzialmente potrebbe essere la causa della recidiva tumorale e delle metastasi. Le cellule staminali del tumore mammario sono regolate sia da segnali intrinseci che da segnali estrinseci derivanti da elementi appartenenti al microambiente tumorale che le circonda, la cosiddetta “nicchia” delle cellule staminali tumorali. Tra i segnali intrinseci, i pathways embrionali, come Notch, Wnt e Hedgehog risultano frequentemente deregolati nel carcinoma mammario. In particolare, il segnale di Notch4 svolge un ruolo di notevole importanza nel contesto della staminalitá in quanto la sua attivitá risulta essere significativamente più elevata in cellule staminali di carcinoma mammario rispetto alle cellule tumorali differenziate e la sua inibizione riduce la crescita delle mammosfere e la formazione della massa tumorale in vivo. Il microambiente tumorale costituito da cellule mesenchimali staminali, adipociti, fibroblasti associati al tumore, cellule endoteliali e immunitarie, regola la staminalità, la proliferazione e la resistenza all’apoptosi delle cellule staminali attraverso la secrezione di citochine e fattori di crescita. Nel contesto del microambiente mammario, gli adipociti costituiscono la componente cellulare più abbondante e insieme ai loro fattori secreti, rappresentano i principali protagonisti nelle interazioni tra cellule stromali ed epiteliali. Tra i fattori secreti l’adipochina leptina svolge un ruolo chiave nella tumorogenesi mammaria. Inoltre, dati recentemente pubblicati dal nostro gruppo di ricerca, hanno identificato la leptina, come il principale regolatore del cross-talk tra cellule tumorali mammarie e fibroblasti associati al tumore (CAFs), aggiungendo, per la prima volta, la leptina all'elenco dei fattori di crescita in grado di mediare l’interazione tra tumore e stroma. Pertanto, sulla base di tali osservazioni, l’attenzione è stata rivolta allo studio del possibile ruolo dei fattori secreti dal microambiente tumorale, in particolare della leptina, e dei fattori intrinseci, in particolare di Notch4, nell’influenzare il comportamento fenotipico delle BCSCs. Al fine di valutare il ruolo del microambiente tumorale nella modulazione dell’attività staminale delle cellule di carcinoma mammario, sono stati utilizzati fibroblasti associati al tumore e adipociti maturi, come modelli sperimentali per le cellule stromali e cellule ER+ MCF-7 e ER- MDA-MB-231 come modello di cellule epiteliali di carcinoma mammario. Negli esperimenti di co-coltura, la presenza dei mezzi condizionati ha indotto una maggiore formazione delle mammosfere rispetto alle condizioni di base, suggerendo come fattori secreti dalle cellule stromali possano influenzare l’attività delle BCSCs. Tale risultato è completamente reversato in presenza dei mezzi condizionati depleti della leptina, individuando l’adipochina come mediatore cruciale negli effetti delle cellule stromali sulle BCSCs. Inoltre, sono stati testati gli effetti di un peptide con attività antagonista sul recettore leptinico (ObR), sintetizzato in collaborazione con il laboratorio di Chimica Organica diretto dal Prof. Liguori, sulle cellule di carcinoma mammario cresciute come mammosfere. I risultati ottenuti hanno dimostrato che, antagonizzando il recettore leptinico, l’aumentata formazione di mammosfere indotta dai mezzi condizionati stromali, è significativamente ridotta in presenza del peptide, confermando l’importanza dell’interazione leptina-ObR nel sostegno della crescita delle BCSCs. Al fine di confermare i risultati ottenuti, sono stati valutati gli effetti diretti del segnale leptinico nel mantenimento delle proprietà staminali delle cellule di carcinoma mammario. In primo luogo, è stato osservato che i livelli di mRNA del recettore della leptina risultano maggiormente espressi nelle mammosfere rispetto alle cellule coltivate in adesione. Inoltre il trattamento con leptina è in grado di aumentare significativamente la formazione delle mammosfere, il self-renewal e la popolazione con fenotipo CD44+/CD24- rispetto alle condizioni di controllo, suggerendo che tale adipochina sia direttamente coinvolta nell’induzione dell’attività staminale delle cellule di carcinoma mammario. Successivamente, analisi di microarray condotta in cellule MCF-7 cresciute come mammosfere, ha rivelato che tra i geni differentemente espressi tra il trattamento con leptina e con i mezzi condizionati delle cellule stromali, molti risultano correlati con il fenotipo staminale e con la regolazione del ciclo cellulare. È stato inoltre riscontrata una significativa up-regolazione dei geni codificanti per le heat shock proteins (HSPs), la cui attività è ormai noto essere implicata nei processi di carcinogenesi e di resistenza terapeutica in molti tipi tumorali. In seguito, gli effetti biologici della leptina sono stati saggiati in vivo, utilizzando cellule epiteliali tumorali estratte dai fluidi metastatici (liquido di drenaggio pleurico o ascitico) provenienti da pazienti con carcinoma mammario. I risultati ottenuti dimostrano che la leptina è in grado di aumentare in maniera significativa il numero di mammosfere formate rispetto alle condizioni di controllo in tutti i campioni utilizzati, e tali effetti sono completamente reversati in presenza del peptide. Come parte finale di questo studio, è stata analizzata, in diversi pazienti con carcinoma mammario (n=781), la relazione tra l’espressione genica di ObR e/o HSP90 con l’overall survival mediante analisi di Kaplan-Meier. I risultati hanno evidenziato come le pazienti con elevata espressione di ObR e di HSP90 presentano una ridotta sopravvivenza, suggerendo un loro potenziale ruolo come fattori prognostici. Successivamente è stato valutato il ruolo dei segnali intrinseci, in particolare di Notch4, nella modulazione dell’attività delle cellule staminali di carcinoma mammario nel contesto della resistenza alla terapia endocrina. In primo luogo, sono stati valutati gli effetti degli anti-estrogeni, tamoxifene e fulvestrant, sull’attività staminale, utilizzando come modelli sperimentali cellule epiteliali isolate da tumori mammari ER+, primari e metastatici. I risultati ottenuti hanno dimostrato che l’esposizione al tamoxifene è in grado di aumentare significativamente il self-renewal nella maggior parte dei campioni utilizzati. Successivamente, analisi citofluorimetriche hanno rivelato che l’attività enzimatica dell’ALDH, un altro noto marcatore di staminalità, è significativamente incrementata in seguito al trattamento con tamoxifene e fulvestrant nei campioni isolati da pazienti con tumore mammario, in modelli PDX e linee cellulari ER+. Tali dati suggeriscono che gli anti-estrogeni, somministrati per un breve periodo di tempo, sono responsabili di un’aumentata popolazione di cellule con attività staminale. In seguito, è stato osservato che l’esposizione al tamoxifene e al fulvestrant a breve termine, in modelli PDX e in cellule di carcinoma mammario recettore estrogenico positive (MCF-7, T47D, e ZR-75-1), induce un’aumentata espressione di HEY1 and HES1, geni target di Notch. Inoltre, in cellule MCF-7 resistenti al tamoxifene (TAMR) ed al fulvestrant (FULVR), generate dopo un’esposizione prolungata a tali trattamenti endocrini, è stata riscontrata un’up-regolazione dei geni target di Notch, così come una sua aumentata attività trascrizionale. Analisi di Western Blot, hanno successivamente rivelato che tra i diversi componenti della famiglia dei recettori di Notch, l’espressione di Notch4 e del suo dominio intracellulare attivo (ICD) risultano significativamente incrementate nei modelli resistenti rispetto alle cellule parentali. Inoltre, l’espressione di NOTCH4 e del suo ligando JAG 1 risultano up-regolate dal trattemento a breve termine con tamoxifene e fulvestrant sia in vivo che in vitro, suggerendo come l’attivazione di tale segnale possa rappresentare un evento iniziale nell’acquisizione della resistenza endocrina. Al fine di comprendere meglio il ruolo di NOTCH4 in tale contesto, sono stati generati cloni knock-out, utilizzando una metodica di editing genomico, recentemente descritta, chiamata CRISPR cas9. L’avvenuto knock-out, confermato mediante saggi di genotipizzazione e analisi di Western Blot, ha indotto nelle cellule MCF-7, una significativa inibizione della formazione delle mammosfere, così come una ridotta popolazione ALDH+, effetto ancora più evidente in seguito a trattamento con tamoxifene e fulvestrant. Infine, il segnale di Notch4 è stato inibito mediante l’utilizzo dell’inibitore delle gamma secretasi, RO4929097, ed è stata valutata successivamente l’attività staminale e il potere tumorigenico in vivo. I risultati ottenuti dimostrano che, nei modelli PDX, RO4929097 è in grado di abrogare l’induzione della formazione delle mammosfere, dell’attività dell’ALDH e la capacità tumorigenica, stimolate dal trattamento con anti-estrogeni. In conclusione, i risultati ottenuti in tale lavoro di tesi, identificano la leptina come un importante fattore estrinsico che media l'interazione tra le cellule stromali e le BCSCs. Inoltre, i nostri dati sottolineano l’importanza di Notch4, come fattore intrinsico, nella regolazione dell’attività staminale delle cellule di carcinoma mammario indotta dal trattamento con anti-estrogeni. Da un punto di vista clinico, tali dati suggeriscono come le strategie terapeutiche volte ad inibire il segnale leptinico e il segnale di Notch4 potrebbero rappresentare un valido approccio per l’eradicazione delle BCSCs, riducendo i fenomeni di resistenza, metastasi e di conseguenza la mortalità delle pazienti con carcinoma mammario.Università della Calabri